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高通量測序技術在無創產前檢測中的應用

2022-03-14 01:59:56
染色體非整倍體是胎兒出生缺陷最常見病因之一,其中以21-三體綜合徵、18-三體綜合徵最為常見,佔所有足月妊娠的0.2%-0.3%。對先天性遺傳病進行產前篩查和產前診斷是優生優育的重要保證。

從取材方法進行分類,產前檢查分為有創性和無創性兩種。有創性產前診斷是目前診斷胎兒染色體疾病的金標準,主要是指通過絨毛活檢術、羊水穿刺術和臍靜脈穿刺術採集胎兒細胞或組織,進行細胞核型分析獲取胎兒染色體信息。有創檢測的準確率為98%~99%,但伴有0.5%~1%的流產風險,同時也會伴有羊水滲漏、宮內感染等風險。因此,有創產前診斷目前僅應用於篩查高風險、高齡妊娠或家庭中生育過遺傳病患兒等情況。傳統的無創性產前檢查主要有超生檢查和孕婦血清學檢測等方法,使用這些方法進行檢測可避免對胎兒和孕婦造成的傷害,但是其靈敏度及特異性有限。產前母體血清學篩查的目標疾病是21、18-三體綜合徵和神經管缺陷,當假陽性控制在5%時,在早孕期、中孕期、早中孕期的檢出率分別為82%-87%、81%、94%-96%。
 

 
正因以上局限促使專家在1997年通過孕育男性胎兒的孕婦外周血血漿Y染色體PCR擴增的方法,證明了孕婦外周血循環中存在胎兒游離DNA(eff DNA),開啟了基於cffDNA無創產前檢測(NIPT)方法。本文將對如何理解並應用NIPT這些問題進行探討。

最近研究發現cffDNA在早、中、晚孕期時含量分別為9.7%、9%、20%,分娩後母體cffDNA快速降解,兩小時內快速消失,半衰期為16.3分鐘,再次妊娠cffDNA的檢測不受上次妊娠影響。由此得知孕婦外周血中cffDNA微量存在、非整倍體檢測過度依賴於特定基因位點等特點,嚴重限制了使用常規分子學方法檢測胎兒染色體非整倍體的技術可靠性和使用範圍。而新一代高通量測序方法的出現,可輕易實現同時針對百萬以上單分子多拷貝PCR克隆陣列的檢測,該方法對游離DNA的研究已經成功應用到無創產前檢測、癌症和器官移植標誌物研究等方面。

基於高通量測序技術的NIPT
在2008年有專家開創性地使用第二代高通量測序技術,對孕婦外周血漿進行測序,成功檢測出21-三體綜合徵胎兒,後續研究表明該方法的敏感性僅受限於測序序列的數據量。之後有研究對該方法進行了驗證,通過篩查高風險孕婦,結果表明該方法針對21-三體綜合徵胎兒有100%檢測靈敏度和97.9%的特異度。有研究對包括易位型三體、嵌合體及復雜變異在內的胎兒非整倍體進行檢測,發現13、18、21、X、Y五大染色體非整倍體的檢測靈敏度為78.6%~100%,特異度為99.8%~100%,並發現某個染色體為非整倍體時並不影響其他染色體整倍體狀態的分析。近期北京協和醫院完成的一項以低危為主的孕婦進行游離胎兒DNA檢測的研究,該技術對21、18、13號染色體非整倍體的檢測靈敏度100%,特異度99.94%,假陽性率0.12%。綜上更進一步驗證了NIPT未來在中等風險及低風險孕婦人群的應用。
 

基於高通量測序的胎兒游離DNA檢測技術作為針對胎兒染色體非整倍體產前篩查技術的優勢在於:①無創傷性,避免了有創性取材方式帶來的污染、感染及胎兒流產風險②對於目標疾病有高的檢出率和低的假陽性率③適用的孕週範圍較大,從孕9週以後至中孕期④流程簡單,質量控制相對容易⑤技術擴展性強。

但該技術還存在多種局限:①目前篩查的目標疾病尚偏少,僅針對胎兒21、18和13-三體綜合徵,縮小了後續產前診斷的疾病範圍②多胎、嵌合體及父母中存在染色體異常的病例均不適於採用該技術進行篩查③孕婦近期接受過異體輸血、移植手術、細胞治療,孕婦體重超過100kg等將影響無創檢測結果的準確性④檢測費用較高。

丽舍的话:
随着以高通量、自动化为显著特征的二代测序技术的发展,基于该技术的无创产前检测(NIPT)在临床上迅速得以应用,我国也逐渐开始了高通量测序技术的应用。从以上各专家研究看来,由于NIPT作为目标疾病指向精确的产前筛查技术,目前还难以取代现有的产前筛查-诊断技术。因尚缺乏在中低风险孕妇人群中的临床数据,目前只推荐高危人群和有特殊需求的人群,包括高龄、血清学筛查高危、有不良孕史的孕妇等。而且国内外的临床产前专家及行业共识尚未对该项技术的详细实验操作、生物信息分析以及结果解读推出标准,这预示着未来NIPT向临床推进时仍需大量工作,丽舍也会持续跟踪。

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